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淺談產前診斷中運用分子生物學技術的作用

來源:原創論文網 添加時間:2018-09-12

  摘要:產前診斷是預防遺傳病患兒出生的主要途徑。隨著分子生物學技術的迅猛發展, 相應產生了分子細胞生物學的新技術, 這些技術包括熒光原位雜交技術 (FISH) 、定量熒光聚合酶鏈式反應 (QF-PCR) 、引物原位標記技術 (PRINS) 等。本文對這些分子生物學方法在產前診斷中的應用作一綜述。

  關鍵詞:產前診斷; 分子生物學技術; 遺傳學;

分子生物學論文配圖

  產前診斷又稱宮內診斷, 是近代醫學遺傳學與臨床醫學相結合而發展起來的一門新興學科。它是通過直接或間接的方法對孕期胎兒情況進行檢測, 了解胎兒在子宮內的健康狀況, 有無遺傳病或先天性畸形, 繼而采取一些必要的措施預防嚴重遺傳病, 先天性畸形和智力障礙患兒的出生, 從而提高出生人口的素質, 是預防性優生學的重要組成部分。

  傳統的產前診斷途徑采用胎兒細胞進行遺傳學分析獲得染色體核型。其有檢測周期長、標本培養后易污染等缺點[1]。隨著分子生物學技術的迅猛發展, 相應產生了分子細胞生物學的新技術, 這些技術包括熒光原位雜交技術 (FISH) 、定量熒光聚合酶鏈式反應 (QF-PCR) 、引物原位標記技術 (PRINS) 等。分子生物學的興起使得我們對一些具有嚴重出生缺陷或者遺傳病等問題在宮內期即可作出診斷并及時采取科學合理的對策措施。現將對這些分子生物學方法在產前診斷中的應用作一綜述。

  1 熒光原位雜交 (FISH)

  FISH是以熒光標記單鏈核苷酸為探針, 與待測樣本的單鏈核苷酸進行原位雜交, 形成的雜交雙鏈核酸在熒光顯微鏡下對熒光信號進行辨別和計數[2]。據研究報道[3], 它彌補了經典顯帶法不足, 具有快速、靈敏、可靠的特點, 可較精確地測定各種染色體數目和結構畸變, 較染色體核型分析省時省力, 因此, 在基因定位、染色體數目和結構異常等研究領域得到廣泛的應用[4]。但該技術步驟繁瑣, 取材時間有限, 細胞培養耗時長, 可能會發生污染導致培養失敗, 細胞質量要求高, 技術水平要求高。

  Lee[5]等利用特異性的探針運用FISH的方法檢測未經培養的羊水細胞, 檢出一例嵌合型DS, 該胎兒生后表現出典型的DS特征。此項研究結果證實了FISH可以作為常規核型分析的補充, 用于檢測未經培養的羊水細胞, 特別是一些超聲有異常發現的病例。Elias[6]小組和Ganshirt[7]小組分別報道了他們對從孕母血分離的患兒有核紅細胞進行的FISH檢測, 細胞顯示3個雜交信號的百分率一般較低, 分別為2.8%~74%和10%~17%, Elias將三體信號百分率為74%的標本的FISH的結果與其羊水穿刺及流產胎兒組織染色體核型對比, 證實確為21三體, 進一步分析證實該例檢測時為流產早期, 母血流中存在較多胎兒三體細胞, 因此三體信號百分率相對較高。Suhubert[8]等和黃艷儀[9]等研究證明FISH技術也可應用于Down綜合征診斷領域。朱俊真[10]等采用不用經過培養的絨毛、羊水細胞直接應用FISH分析, 尤其是其建立的一標二區FISH直接檢測染色體及間期細胞, 選用X、Y、13、18、21號特異性探針, 首先做培養后染色體和未經培養的絨毛、羊水細胞對照試驗, 和對就診的孕婦中的130例高危孕婦, 成功地進行產前診斷, 結果顯示, 在絨毛組織正常核型標本細胞中FISH呈現2個雜交信號, 信號顯示范圍90%~99%, 平均為98.6%。羊水細胞在正常核型FISH呈現范圍為91%~98%, 平均為96.2%。Bianchi[11]用轉鐵蛋白受體 (TFR) 的單克隆抗體分選富集胎兒細胞 (TFR存在于胎兒有核紅細胞上, 而母體細胞尚無此受體) , 同時用特異性Y染色體探針和21號染色體探針同時進行熒光原位雜交。結果TFR陰性細胞中顯示2個21號染色體信號而無Y染色體信號, 證實為母體細胞;TFR陽性細胞中發現3個21號染色體信號和1個Y染色體信號, 證實該孕婦懷有21三體男性胎兒。但是富集過程中胎兒細胞的丟失, 母血細胞的污染, 操作的復雜, 費用的昂貴等問題尚未解決。

  2 定量熒光聚合酶鏈式反應 (QF-PCR)

  該技術[12,13]是在PCR反應系統中加入熒光標記的特異性探針, PCR擴增DNA樣本, 據相關軟件檢測后判斷出其是何種引物擴增的標志物及該標志物指示的染色體數目[14]。該技術具有靈敏度較高、無創傷、簡單、快速、特異度高、成本較低、取材方便等優點[15]。但對于易位型、嵌合型染色體三體, 異常核型細胞數較少時可能會漏診[16]。

  Lee等[17]應用4個位于21號染色體上的STR作為遺傳標記, 利用定量熒光聚合酶鏈式反應 (QF-PCR) 對221例未經培養的羊水細胞進行DS診斷, 敏感性、特異度和有效診斷率分別為95.4%, 100%和99.5%。QF-PCR能利用母體外周血中的胎兒紅細胞診斷21三體[18], 其結果顯示, 隨著被分析的STRs標記的數目的增加, 診斷非整倍體的統計學概率會隨之升高。如果只使用一種21號染色體的STRs標記, 那么PCR對于那些同一的母胎等位基因是無意義的。但是如果多個靶位點被擴增, 那么熒光峰值的位置和強度就因為峰的重疊而變得難以分析, 因此在他們的研究中選擇了2-3個21號染色體STR標記。Cha等[19]從9位因胎兒染色體異常終止妊娠婦女的外周血中分離胎兒有核紅細胞進行D18S535基因PCR擴增成功, 并成功診斷出1例18三體, 該方法不但可減少由傳統的羊膜腔穿刺、絨毛活檢或臍靜脈穿刺引起的不良反應, 并且突破了進行羊膜腔穿刺及絨毛活檢的妊娠周數的限制。

  3 引物原位標記技術 (PRINS)

  引物原位標記是一種將PCR與FISH結合的分子細胞遺傳學技術, 由Koch等于1989年首先建立, 其基本原理是將未標記的寡核苷酸探針與已變性的染色體特定部位雜交, 在DNA聚合酶作用下, 在染色體玻片原位以標記的脫氧核甘酸為原料, 于合適的溫度進行鏈的延伸, 合成含有標記的DNA鏈。合成的新鏈通過相應的檢測系統檢測。PRINS與FISH技術相比, 具有特異性高、快速、準確、經濟、重復性好的優點[20], 在判斷染色體數目方面有明顯的優勢, 即使染色體形態不佳, 也可以根據信號直接得出結論。

  Mennicke等[21]用PRINS檢測262個未培養羊水細胞間期18號、X和Y染色體, 結果與用FISH方法分析結果相一致。PRINS技術的操作較FISH更為快速簡捷, 整個實驗在4~5小時內即可完成, 所采用的寡核苷酸引物不象FISH那樣需進行復雜的探針制備價格低廉, 更適宜在國內推廣應用。但對標本要求較高, 反應條件不易掌握, 且需要專門的儀器進行反應。

  綜上所述, 各種方法各有優劣, 相互之間仍無法代替。因此, 尋找一種快速、準確、安全的產前診斷方法仍是一項重要的課題。

  參考文獻
  [1]Caine A, Naltby A E, Parkin C A, et al.Prenatal detection of Down’syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, 21 by FISH or PCR without a full karyotype:A cytogenetic risk assessment[J].Lancet, 2005, 366:123-128.
  [2]Karen S, Andre VS, Inge I.Preimplantation genetic diagnosis[J].Lancet, 2004, 47 (3) :297-303.
  [3]Xiao HM, Tan YQ, Li LY, et al.Prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies on uncultured amniotic fluid cells by fluorescence in situ hybridization[J].Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 2004, 21 (6) :608-610.
  [4]Luke S et al.Cell Veton, 1997;4 (1) :16-31.
  [5]Lee J, Stanley JR, Vaz SA, et al.Downsyndrome with pure partial trisomy 21q22 due to a patemal insertion (4;21) uncovered by uncultured amniotic fluid interphase FISH[J].Am J Med Genet A, 2005, 132 (2) :206-208.
  [6]Elias S et al.Ann NY Acad Sci, 1994, 731:80-91.
  [7]Ganshirt I, et al.Ann NY Acad Sci, 1994, 731:103-114.
  [8]Suhubert R, Raff K, Schwanitz G.Molecular-cytogenetic investigations of ten term placentae in cases of prenatally diagnosed mosaicism[J].Prenat Diagn, 1996, 16:907-913.
  [9]黃艷儀, 孫筱放, 黎青, 等.應用熒光原位雜交技術診斷羊水細胞染色體異常[J].中華婦產科雜志, 1999, 34 (3) :153-155.
  [10]朱俊真, 余小平, 楚偉, 等.熒光原位雜交技術與應用研究行快速產前診斷[J].中國優生與遺傳雜志, 2005, 13 (10) :41-42.

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