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土壤改良劑對草莓園土壤細菌群落結構的改變

來源:原創論文網 添加時間:2019-06-26

  摘    要: 研究旨在探究不同土壤改良劑的使用對草莓種植土壤中細菌群落結構, 細菌總數、細菌多樣性的影響, 為土壤改良劑的高效利用奠定基礎。選擇北京市兩處草莓種植生態農場, 通過施加土壤改良劑 (EM菌, 靠山多霸) 于草莓種植土壤中, 經一季草莓種植后, 收集不同處理的土壤樣品, 利用高通量測序比較土壤改良劑對草莓種植土中細菌群落結構的影響, 從土壤微生物的角度探究EM菌、靠山多霸對草莓種植土壤的影響。研究結果顯示:土壤調理劑的施用增加了土壤細菌總數, 改變了土壤細菌多樣性, 同時也明顯改變了不同分類水平下各類細菌所占比重。該研究證明土壤調理劑的合理使用對于提升土壤微生物多樣性, 調整微生物群落結構, 進而促進植物生長具有潛在的利用價值。

  關鍵詞: 土壤改良劑; 草莓種植土壤; 高通量測序; 細菌群落結構;

  Abstract: To investigate the effects of two soil amendments on bacterial community structure, the total number of bacteria and bacterial diversity of strawberry planting soil, soil samples were selected from two strawberry ecological farms in Beijing, treated with two different commercial soil amendments, namely effective microorganisms (EM) agent and Kaoshanduoba agent, before sowing. And the bacterial communities were analyzed by high-throughput sequencing method. The results indicated that two soil amendments increased the total number of bacteria, altered the activity of soil bacteria, and meanwhile changed the composition of the bacterial community. Our study demonstrated that soil amendments could increase total bacteria number, change planting soil bacteria diversity and structure, and had huge potential to promote plant growing.

  Keyword: soil amendments; strawberry planting soil; high-throughput sequencing; bacterial community structure;

  0、 引言

  土壤改良劑是指用于改善土壤理化性質, 間接促進植物生長的物料, 主要作用于提升土壤肥效、增加作物產量等方面[1,2]。EM (Effective Microorganisms) 菌, 即有效微生物群, 于20世紀60年代研發, 90年代用于生產。其主要成分為光合菌類、乳酸菌類、酵母菌類、放線菌類等80余種微生物[3]。目前主要用于種植、養殖、環保等領域, 可有效促進植物生長、改善種植土壤性狀, 增強植物抗逆性, 提高土壤酶活性, 已經被包括中國在內的全世界60多個國家、地區廣泛使用[4,5,6]。土壤微生物是土壤的重要有機組成, 同時也是土壤生態系統中最為活躍的部分。土壤微生物對于環境的作用一方面體現在改善土壤質量, 提升土壤肥力, 另一方面在于調控土壤中植物的生長發育, 是評價土壤質量的關鍵生物學指標[7]。土壤細菌是土壤微生物重要組分, 約占其總量的70%~90%[8]。按照土壤細菌不同的形狀可將其分為球菌、桿菌、螺旋菌等。根據土壤細菌的營養方式可分為自養、兼性自養與異養細菌[9]。不同土壤改良劑的加入, 不僅改善了植物生長狀況, 同時也對種植土壤中的微生物群落結構, 微生物總量、多樣性產生一定影響。本研究選擇了北京市兩處草莓種植生態農場, 通過施加土壤改良劑 (北京中科惠農技術中心生產的EM菌和山東靠山生物科技有限公司生產的靠山多霸微生物改良劑) 于草莓種植土壤中, 經一季草莓種植后, 收集不同處理的土壤樣品, 利用高通量測序技術, 針對使用不同改良劑的草莓種植土, 探究其細菌群落的變化情況。研究旨在解釋土壤改良劑對草莓種植土壤細菌群落結構的影響, 以期為土壤改良劑的高效、綠色應用提供科學依據。

  1、 材料與方法

  1.1、 樣品采集

  用于測定土壤微生物群落結構的草莓種植土壤分別取自北京市順義區地源遂航農莊草莓采摘園和北京市昌平區蟲樂農莊草莓采摘園。其中地源遂航農莊處理包括:空白處理組 (S1) , EM菌添加組 (S2) , 靠山多霸添加組 (S3) ;蟲樂農莊處理包括:空白處理組 (S4) , EM菌添加組 (S5) 。土壤調理劑按照說明書于種植之前施加至草莓種植土壤中, 所有土壤樣品均為種植一季草莓之后的溫室土壤。
 

土壤改良劑對草莓園土壤細菌群落結構的改變
 

  1.2、 土壤細菌群落結構測定

  準確稱量10 g不同處理的土壤樣品, 使用Power Soil DNA extraction試劑盒 (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA) , 按照說明書步驟提取DNA, 并于-20℃環境下保存。

  按指定測序區域, 合成帶有Barcode的特異引物對樣本的16S rDNA V4區域進行擴增:前端引物為515F (5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’) , 反向引物為806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) ;PCR在20μL的反應體系中進行, 包括:10xExTaq Buffer:5μL, dNTP (2.5 mmol/L) :4μL, 10 PM前向引物:2μL, 10 PM反向引物:2μL, DNA模板:25 ng (XμL) , ExTaq酶:0.25μL, 補水: (36.75-X) μL。

  PCR反應參數為: (1) 94℃5 min, (2) 30個循環:94℃1 min, 48℃1 min, 72℃1 min, (3) 72℃10 min。

  PCR擴增產物采用paired 150-bp MiSeq 2000測序系統 (Illumina) 進行配對末端測序, 采用Qiime軟件平臺 (v1.9) , UCLUST方法進行操作分類單元 (OUT) 聚類, OTU中序列相似性設為97%。試驗在農田土壤污染防控與修復北京市重點實驗室, 于2017年5—12月份進行。

  2 、結果與分析

  2.1、 土壤細菌群落組成分析

  針對土壤細菌群落門水平上進行分析, 如圖1所示變形菌門 (Proteobacteria) 在門水平上占主導地位, 且受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:變形菌門所占比重由空白 (S1) 48.4%下降為42.7%, 加入靠山多霸 (S3) 變形菌門所占比重上升至52%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中變細菌門相對豐度由41.6%上升至49.2%。擬桿菌門 (Bacteroidetes) 在門水平上所占比重次之, 且受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:擬桿菌門所占比重由空白 (S1) 14.9%上升為15.7%, 加入靠山多霸 (S3) 擬桿菌門所占比重下降至12.7%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中擬桿菌門相對豐度由5.7%上升至11.6%。酸桿菌門 (Acidobacteria) 在門水平上占據第三的位置, 同樣受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:酸桿菌門占比重由空白 (S1) 8.9%上升為15.2%, 加入靠山多霸 (S3) 酸桿菌門所占比重變化不明顯 (8.8%) 。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中酸桿菌門相對豐度由16.1%下降至11.7%。

  針對土壤細菌群落綱水平上進行分析, 圖2所示α-變形桿菌綱 (Alphaproteobacteria) 在綱水平上占主導地位, 且受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:α-變形桿菌綱所占比重由空白 (S1) 21.4%下降為15.1%, 加入靠山多霸 (S3) α-變形桿菌綱所占比重下降至18.2%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中α-變形桿菌綱相對豐度由14.9%上升至23.4%。γ-變形菌綱 (Gammaproteobacteria) 在綱水平上所占比重次之, 且受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:γ-變形菌綱所占比重由空白 (S1) 13.5%下降為10%, 加入靠山多霸 (S3) γ-變形菌綱所占比重上升至20.5%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中γ-變形菌綱相對豐度由9%下降至8%。酸桿菌綱 (Acidobacteria) 在綱水平上占據第三的位置, 同樣受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:酸桿菌綱所占比重由空白 (S1) 8.2%上升為13.8%, 加入靠山多霸 (S3) 酸桿菌綱所占比重下降至7.6%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中酸桿菌綱相對豐度由12.9%下降至10.7%。

  圖1 門水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度
圖1 門水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度

  圖2 綱水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度
圖2 綱水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度

  針對土壤細菌群落目水平上進行分析, 圖3所示鞘脂桿菌目 (Sphingobacteriales) 在目水平上占主導地位, 且受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:鞘脂桿菌目所占比重受EM菌影響不大, 所占比重為9%~10%, 加入靠山多霸 (S3) 鞘脂桿菌目所占比重下降至5.7%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中鞘脂桿菌目相對豐度由2.7%上升至7.9%。紅桿菌目 (Rhodobacterales) 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中受到不同處理的影響不大, 所占比重約為6%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中紅桿菌目相對豐度由7%上升至8%。針對黃色單胞菌目 (Xanthomonadales) 進行分析, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:黃色單胞菌目所占比重由空白 (S1) 7.3%下降為4.3%, 加入靠山多霸 (S3) 黃色單胞菌目所占比重上升至15.8%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中黃色單胞菌目相對豐度變化不大, 約為2%~3%。

  針對土壤細菌群落科水平上進行分析, 如圖4所示紅桿菌科 (Rhodobacteraceae) 在科水平上占主導地位, 且受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:紅桿菌科目所占比重受EM菌影響不大, 由空白6.9% (S1) 略微下降至6.1% (S2) , 加入靠山多霸 (S3) 紅桿菌科所占比重略微下降至6.3%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中紅桿菌科相對豐度由7.2%上升至8.5%。芽單胞菌科 (Gemmatimonadaceae) 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中受到不同處理的影響較大, 所占比重由空白組 (S1) 所占6%的比重經EM菌處理 (S2) 下降至4.8%, 靠山多霸處理后比重上升至7.2%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中芽單胞菌科相對豐度由5.5%上升至6.1%。針對鞘脂單胞菌科 (Sphingomonadaceae) 進行分析, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:鞘脂單胞菌科所占比重由空白 (S1) 為8%, 加入EM菌下降為3.1%, 加入靠山多霸 (S3) 鞘脂單胞菌科所占比重下降至6%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中鞘脂單胞菌科相對豐度由3%上升為6%。

  圖3 目水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度
圖3 目水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度

  圖4 科水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度
圖4 科水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度

  針對土壤細菌群落屬水平 (Photobacterium) 在屬水平上所占比重次之, 且受到不同處理的影響, 在地源遂航上進行分析, 圖5所示鞘脂單胞菌屬 (Sphingomonas) 在屬水平上占主導地位, 且受到不同處理的影響較大, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:鞘脂單胞菌屬所占比重由空白 (S1) 7.7%下降為2.6%, 加入靠山多霸 (S3) 鞘脂單胞菌屬所占比重下降至4.4%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中鞘脂單胞菌屬相對豐度由2.8%上升至7.4%。發光桿菌屬農莊所采取的土壤樣品中:發光桿菌屬所占比重由空白 (S1) 3%下降為2.5%, 加入靠山多霸 (S3) 發光桿菌屬占比重下降至2%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中發光桿菌屬相對豐度由3.4%下降至2.5%。溶桿菌屬 (Lysobacter) 在屬水平上占據第三的位置, 同樣受到不同處理的影響, 在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:加入EM菌 (S3) 對于溶桿菌屬所占比重影響不大, 加入靠山多霸 (S3) 變細菌門所占比重由1%上升至5%。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:相比與空白處理 (S4) 加入EM菌 (S5) 處理組中溶桿菌屬相對豐度保持相對穩定 (0.3%) 。

  2.2 、土壤細菌多樣性分析

  Chaol指數即用chaol算法估計樣本中所含OTU數目的指數, 用于反映樣本中微生物總數。香農-維納指數是用來估算樣本中微生物多樣性指數之一。它常用于反映Alpha多樣性, 值越大說明群落多樣性越高。

  如圖6所示:在地源遂航農莊所采取的土壤樣品中:加入EM菌 (S2) 靠山多霸 (S3) 菌提升了Chao1指數和香農-維納指數, 即提升了土壤細菌總數與群落多樣性。在蟲樂農莊采取的土壤樣品中:加入EM菌提升了Chao1指數同時降低了香農-維納指數, 即提升了細菌總數, 抑制了群落多樣性。

  圖5 屬水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度
圖5 屬水平上添加不同改良劑后草莓種植土細菌相對豐度

  圖6 添加不同改良劑后草莓種植土細菌多樣性指數 (A:chao1指數, B:香農-維納指數)
圖6 添加不同改良劑后草莓種植土細菌多樣性指數 (A:chao1指數, B:香農-維納指數)

  3 、結論

  土壤調理劑EM菌、靠山多霸作為高效土壤調理劑, 在調節植物生長的同時, 也改變了種植土壤微生物群落結構。高通量測序結果顯示, 不同分類水平下, 兩種土壤調理劑均改變了主要細菌所占比重, 提升了細菌總數, 改善了細菌多樣性。兩種土壤調理劑對于提升土壤微生物多樣性, 調整微生物群落結構, 進而促進植物生長具有潛在的利用價值。

  4 、討論

  EM菌和靠山多霸微生物改良劑是北方地區草莓種植常用的土壤改良劑, 在農業生產、特別是水果種植領域具有廣泛的應用空間, 目前的研究多集中于其對植物生長的促進作用, 而針對其影響土壤微生物特別是細菌群落結構、多樣性的研究較少。研究證明, 靠山多霸的施用可以有效改良土壤理化機構, 如提升土壤有機質含量、pH值、孔隙度, 降低土壤容重;同時顯著提升花生、蘋果、甜瓜等作物的產量與品質[10,11,12,13]。與之類似, 通過施用EM菌改良農田土壤, 可以有效促進植物根系的生長、提升根系活力、提升作物光合作用, 提升植物品質[14,15,16,17,18];同時改善土壤理化性狀:提升土壤有機質、有效磷含量、土壤酶活性[6,19,20]。綜上所述可以得出結論:土壤調理菌劑EM菌、靠山多霸的施用提升改變土壤理化性狀, 改善細菌生存環境, 同時提升細菌數量, 改善植物生長微環境, 進而促進植物的生長。

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