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香蕉皮中一株未知菌W的分離和鑒別

來源:原創論文網 添加時間:2019-06-26

  摘    要: 為了鑒定新鮮香蕉皮中通過分離純化得到的一株細菌, 本實驗采用觀察細菌菌落形態特征、生理生化鑒定試驗以及16S rDNA基因序列分析等方法對該分離菌進行鑒定.結果表明, 該分離菌為革蘭氏陰性菌.此菌不能降解棉子糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、枸櫞酸鹽等, 但可以降解尿素、甘露糖.經鑒定該菌株屬于變形菌門、莫拉菌科、不動桿菌屬細菌.該菌種在香蕉皮中的發現豐富了不動桿菌屬細菌在環境中的分布, 也為香蕉皮內生菌種的進一步開發和利用奠定了研究基礎, 因此本研究工作具有重要的理論意義和潛在的應用價值.

  關鍵詞: 香焦皮內生菌; 純化分離; 生化鑒定;

  Abstract: In order to identify a strain of bacteria obtained by separation and purification in fresh banana peel, this experiment aimed to identify the isolate this bacteria strain by using the method of observing bacterial colony morphology, physiological and biochemical identification test and 16 S rDNA gene sequence analysis.The results showed that the bacteria was Gram-negative bacteria.It could not degrade raffinose, arabinose, maltose, sucrose, glucose, mannitol, lactose, citrate, etc.But it could degrade urea and mannose.The strain was identified as Proteobacteria, Moraxaceae, and Acinetobacter.The discovery of this species in banana peel enriches the distribution of Acinetobacter bacteria in the environment.It also lays a research foundation for the further development and utilization of endophytic species of banana peel.Therefore, this research work has important theoretical significance and potential application value.

  Keyword: Endophyte; Separation; Identification;

  內生菌是指存活于植物組織內, 但不引發宿主植物出現明顯感染癥狀的微生物類群, 其與宿主存在著和諧的共生關系[1,2,3,4].存在新鮮果皮中的內生菌具有著廣闊的研究前景和利用價值.香蕉 (MusananaLour.) 芭蕉科芭蕉屬植物, 又指其果實, 熱帶地區廣泛種植.而在我國香蕉已有3000多年的栽培歷史[5], 因其氣味芬芳, 肉質軟而滑膩, 爽口甘甜, 深受人們的喜愛.香蕉被聯合國糧農組織 (FAO) 定位為發展中國家僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物.據統計, 2009年農產品貿易中, 香蕉僅次于小麥、大豆和玉米, 位居第4位[6].香蕉中香蕉皮占全果質量的35%~41%[7].生活中, 香蕉皮一般會被使用者直接丟棄, 易造成環境的污染[8].本試驗從新鮮香蕉皮中分離純化一株未知細菌, 并對該菌株進行細菌特征觀察、生理生化鑒定及16S rDNA基因序列分析.目前, 對香蕉皮的研究主要是對香蕉皮色素的提取、有效活性物質提取等[9], 而關于香蕉皮內生菌的研究鮮有報道.而本研究為對一株來源于香蕉皮的內生菌進行分離鑒定, 并對其生物活性開展的研究, 具有重要的現實意義和開發利用的潛力, 為香蕉皮內生菌種的開發和利用奠定了研究基礎.

  1 、材料

  1.1、 實驗材料

  市售新鮮香蕉:香蕉皮表面含有少量黑斑或無黑斑.

  1.2、 培養基

  LB固體培養基:胰化蛋白胨10 g, 酵母提取物5 g, NaCl 5 g, 15 g瓊脂粉, 搖動容器直至溶質溶解.用5 mol/L NaOH調pH至7.4, 去離子水定容至1 L.加熱溶解, 121℃高壓滅菌30 min.
 

香蕉皮中一株未知菌W的分離和鑒別
 

  1.3 、試劑

  硫酸雙氫鏈霉素、青霉素G鉀、PCR試劑盒、乳酸石炭酸棉藍染色液、5%石炭酸水溶液、75%酒精、0.1%升汞等.

  1.4、 儀器

  生化培養箱 (ZHWY-200D) 、超凈工作臺、生物顯微鏡等.

  2 、實驗方法

  2.1、 菌種分離及形態學觀察

  選取新鮮香蕉皮, 用無菌水、75%酒精和0.1%升汞處理后, 切成均勻小片, 與果肉接觸部分置于含鏈霉素 (50~100 mg/L) 和青霉素 (100~300 mg/L) 的LB培養基上.于25~35℃黑暗條件下培養, 待平板上長出肉眼可見的菌落時, 采用平板劃線的方法分離細菌, 繼續培養.連續多代純化, 即可獲得生長優良的菌種, 將所得的純化菌株接種到斜面上, 4℃冰箱中保存.選擇形態特征明顯的單一菌落, 觀察其形態特征及其生長情況, 并挑取培養基上的菌落進行革蘭氏染色, 鏡檢觀察.

  2.2 、細菌的生理生化鑒定

  將純化后的菌株純培養物進行糖發酵試驗、尿素試驗、硝酸鹽還原試驗、枸櫞酸鹽試驗等各項生理生化試驗.置于34℃恒溫培養24 h, 根據東秀珠等人所著的《常見細菌系統鑒定手冊》判定結果.

  2.3 、細菌的16SrDNA基因序列擴增及其序列分析

  采用細菌基因組DNA提取試劑盒, 按照革蘭氏陰性細菌提取基因組的方法, 提取需鑒定菌株的基因組.按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取目標菌株的基因組DNA, 以其為模板, 利用16S rDNA序列擴增通用引物進行PCR擴增.PCR產物的核酸序列送往蘭州領先生物技術有限公司進行測序.測序結果與NCBI中的BLAST程序進行序列同源性比對分析, 選取與分離菌序列相似性高的序列, 利用MEGA5.1軟件手動調整序列, 自展數 (bootstrap) 為1 000, 模型Kimura 2-parameter model (K2) , 構建鄰接法 (Neighbor-joining, NJ) 系統發育樹.

  3、 結果與分析

  3.1、 形態學特征

  經形態學初步鑒定表明, 該菌株為革蘭氏陰性, 球桿狀, 不運動, 單個或多個排列, 不產芽孢.在LB培養基中34℃培養24小時, 形成圓形、隆起、邊緣整齊、表面粗糙、干燥粉末狀, 初期呈白色, 后期中間呈墨綠色, 邊緣呈白色的菌落, 產黃色素.初步命名為W.

  3.2、 生理生化特征

  該細菌的生理生化特征符合不動桿菌的基本特征, 不能降解硝酸鹽、淀粉、蔗糖、阿拉伯糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露糖, 但可以利用甘露糖、尿素 (見表1) .

  表1 細菌W生理生化鑒定結果
表1 細菌W生理生化鑒定結果

  3.3、 16SrDNA基因序列測定結果及系統發育樹分析

  根據相關文章表明[10,11,12,13], 一般16S rDNA序列同源性大于99%, 可以認為是同一個種.16S rDNA序列同源性小于98%, 可以認為不屬于同一個種.同源性小于95%, 可以認為不屬于同一個屬.

  經鑒定, 細菌W的16S rDNA的1411個核苷酸得到有效的擴增.將細菌W的16S rDNA基因序列進行Blaste比對分析, 發現與GeneBank數據庫中的Acinetobacter guillouiae不同菌株16S rDNA序列的相似性高達99%.系統發育樹結果顯示, 分離菌W與Acinetobacter guillouiae聚為一簇, 親緣關系最近, 而與其他細菌親緣關系較遠.結合生理生化特征, 可判斷分離菌屬于不動桿菌屬.

  圖1 細菌W的16S rDNA全序列的系統發育樹
圖1 細菌W的16S rDNA全序列的系統發育樹

  4、 討論

  不動桿菌是條件致病菌, 根據相關文章報導[14,15], 其廣泛分布于水、土壤、醫院環境和人體皮膚表面, 而不同種類的不動桿菌在外界的分布情況, 到目前為止還沒有系統的研究.據相關報導[16,17], 在43%健康個體的皮膚上可分離到不動桿菌, 也可在健康成年人的口腔及呼吸道分離得到.所以它已成為醫院獲得性感染的主要致病菌之一, 因此如何治療不動桿菌引起的感染已成為臨床關注的重點.近年來, 還發現某些不動桿菌還具有降解多環芳烴的作用, 所以, 不動桿菌在石油污染的環境治理中有著良好的研究價值, 在石油烴降解方面具有良好的應用前景.

  到目前為止, 鮮有關于從香蕉皮中分離得到不動桿菌屬細菌的報導, 而本研究從新鮮香蕉皮中分離純化獲得一株內生菌, 并對該菌進行形態特征觀察、生理生化鑒定試驗以及16S rDNA基因序列的分析, 確定了該菌為不動桿菌屬細菌.該菌種在香蕉皮中的發現豐富了不動桿菌屬細菌的分布, 也為香蕉皮內生菌種的進一步開發和利用奠定了研究基礎, 因此本研究工作具有重要的理論意義和潛在的應用價值.

  5、 結論

  本研究從新鮮香蕉皮中分離出未知菌W, 對其進行了13項生理生化試驗, 反應結果與不動桿菌屬細菌生理生化指標相似.對該菌株的16S rDNA基因序列進行測序分析, 通過Blaste與GenBank中相關數據比對以及利用MEGA5.1軟件構建系統發育樹, 分析結果表明, 該菌株與Acinetobacter guillouiae的相似性最高, 因此判斷該菌株W為不動桿菌屬細菌.

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